habarlar

IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) β-galaktosidaza substratyň meňzeşligi, ýokary täsir edip bilmeýär.IPTG induksiýasynda, induktor repressor belogy bilen toplum döredip biler, şeýlelik bilen, repressor belogynyň üýtgemegi, maksat geni bilen birleşdirilip bilinmez we maksatly gen täsirli beýan ediler.Şeýlelik bilen synag wagtynda IPTG konsentrasiýasyny nädip kesgitlemeli?Ulysy gowumy?
Ilki bilen, IPTG induksiýa prinsipine düşüneliň: E. coliniň laktoza operonynda (elementinde) β-galaktozidaza, permeaz we asetiltransferaza kodlaýan Z, Y we A üç sany gurluş geni bar.lacZ laktozany glýukoza we galaktoza ýa-da allo-laktoza öwürýär;lacY daşky gurşawdaky laktoza öýjük membranasyndan geçip, öýjüge girýär;lacA asetil toparyny asetil-CoA-dan to-galaktozide geçirýär, bu zäherli täsiri aýyrmagy öz içine alýar.Mundan başga-da, işleýän yzygiderlilik O, başlangyç yzygiderlilik P we kadalaşdyryjy gen I bar. I gen kody, operator yzygiderliliginiň O ýagdaýyna bagly bolup bilýän, repressor belogy bolup, operon (meta) basylýar we öçürildi.Şeýle hem, başlangyç yzygiderliliginiň ýokarky akymynda katabolik gen işjeňleşdiriji belok-CAP baglanyşdyryjy ýer bar, P yzygiderliligi, O yzygiderliligi we CAP baglanyşyk meýdançasy bilelikde lak operonynyň kadalaşdyryjy sebitini emele getirýär.Üç fermentiň kodlaşdyryş genleri, gen önümleriniň utgaşdyrylan aňladylyşyna ýetmek üçin şol bir kadalaşdyryjy sebit tarapyndan kadalaşdyrylýar.

Laktoza ýok bolsa, lak operon (meta) repressiýa ýagdaýynda.Bu wagt, PI promouter yzygiderliliginiň gözegçiligi astyndaky I yzygiderliligi bilen aňladylan lak repressory O yzygiderliligi bilen baglanyşýar, bu RNK polimerazynyň P yzygiderliliginiň öňüni alýar we transkripsiýa başlangyjyny saklaýar;laktoza bar bolanda, lak operon (meta) induksiýa edilip bilner Bu operon (meta) ulgamynda hakyky induktor laktoza däl.Laktoza öýjüge girýär we allolaktoza öwrülmegi üçin β-galaktosidaza katalizlenýär.Ikinjisi, induksiýa molekulasy hökmünde repressor belogy bilen baglanyşýar we repressor belogynyň O yzygiderliliginden we transkripsiýasyndan bölünmegine sebäp bolýan belok görnüşini üýtgedýär.Izopropiltiogalaktozid (IPTG) allolaktoza ýaly täsir edýär.Bakteriýalar bilen metabolizlenmeýän we gaty durnukly, şonuň üçin barlaghanalarda giňden ulanylýar.

IPTG-iň optimal konsentrasiýasyny nädip kesgitlemeli?Mysal üçin E. coli alyň.
Pozitiw rekombinant pGEX (CGRP / msCT) öz içine alýan genetiki taýdan döredilen ştamm, 50μg · mL-1 Amp bolan LB suwuk gurşawyna sanjym edildi we bir gije 37 ° C-de ösdürildi.Aboveokardaky medeniýet, giňeltmek medeniýeti üçin 1: 100 nisbatynda 50μg · mL-1 Amp bolan 10m çüýşe 50mL täze LB suwuk gurşawyna sanjym edildi we OD600 bahasy 0,6 ~ 0.8 bolanda, soňky konsentrasiýa IPTG goşuldy.0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Şol bir temperaturada we şol bir wagtyň özünde induksiýadan soň, ondan 1 ml bakteriýa ergini alyndy we bakteriýa öýjükleri merkezden gaçyryş usuly bilen ýygnalyp, dürli IPTG konsentrasiýalarynyň belok aňlatmagyna täsirini seljermek üçin SDS-PAGE tabşyryldy. Iň uly belok aňlatmasy bilen IPTG konsentrasiýasyny saýlaň.
Synaglardan soň, IPTG konsentrasiýasynyň mümkin boldugyça uly däldigi ýüze çykarylar.Sebäbi IPTG bakteriýalara belli bir zäherliligi bar.Konsentrasiýadan ýokary bolmak öýjügi hem öldürer;we umuman aýdanymyzda, öýjükde näçe ereýän belok şonça-da gowy bolar diýip umyt edýäris, ýöne köp halatlarda IPTG konsentrasiýasy aşa köp bolsa, köp mukdarda goşulma emele geler diýip umyt edýäris.Beden, ýöne ereýän belogyň mukdary azaldy.Şonuň üçin iň amatly IPTG konsentrasiýasy köplenç näçe uly bolsa, şonça-da pes bolýar.
Genetiki taýdan işlenip düzülen ştamlary induksiýa etmek we ösdürip ýetişdirmek, maksatly belogyň hasyllylygyny ýokarlandyrmak we çykdajylary azaltmak.Maksatly geniň aňlatmasy diňe ştamyň öz faktorlaryna we plazmada aňlatmagyna täsir etmän, induktoryň konsentrasiýasy, induksiýa temperaturasy we induksiýa wagty ýaly beýleki daşarky şertlere-de täsir edýär.Şonuň üçin, umuman aýdylanda, näbelli bir belok beýan edilmezden we arassalanmazdan ozal, degişli şertleri saýlamak we iň oňat synag netijelerini almak üçin induksiýa wagtyny, temperaturany we IPTG konsentrasiýasyny öwrenmek iň gowusydyr.